Mechanisms of replication fork protection and recovery

Washington University, Saint Louis MO

Investigators

Linked publications & trials

Abstract

Summary:  Many  chemotherapeutics  kill  cancer  cells  by  inducing  DNA  damage  interfering  with  DNA  replication. Replication forks can reverse to aid the repair of DNA damage induced by chemotherapeutics, and  BRCA  proteins  are  key  to  protecting  the  reversed  forks  from  nucleolytic  degradation.  In  absence  of  BRCA,  reversed  replication  forks  are  extensively  degraded  by  nucleases,  leading  to  chemosensitivity.  Moreover,  chemoresistance has been linked to the restored ability of BRCA-­deficient cells to protect forks from degradation  through  mechanisms  that  remain  unclear.  Thus,  understanding  how  cells  protect  stalled  DNA  replication  forks  and promote their recovery is critically important for developing and improving strategies for cancer therapy. In  this application, we combine the expertise from the Zou and Vindigni laboratories to investigate the mechanisms  of  DNA  replication  fork  protection  and  recovery  in  BRCA1-­proficient  (Aim  1)  and  -­deficient  (Aim  2)  cells.  The  Zou lab has extensive experience in the ATR signaling pathway, which is crucial for stabilizing the genome during  DNA replication. The Vindigni lab has discovered principal steps of the fork reversal pathway. Working together,  we  have  uncovered  a  number  of  new  players  involved  in  fork  protection.  In  the  preliminary  studies  leading  to  Aim  1,  we  found  that  ATR plays a  previously unrecognized  role  in protecting  stalled/reversed  replication  forks  from  nucleolytic  degradation  in  BRCA1-­proficient  cells.  We  also  showed  that  ATR  is  required  for  the  efficient  recovery of stalled forks. Based on this premise, we hypothesize that ATR acts locally at stalled replication forks  to protect reversed forks from nucleolytic degradation and to promote their restart after drug removal. Aim 1 will  determine  the  mechanisms by  which  ATR protects  stalled/reversed forks and promotes  fork  restart in  BRCA1-­ proficient cells. In the preliminary studies leading to Aim 2, we have investigated how stalled forks are protected  and how they recover in cells lacking BRCA1. We found that extensively degraded replication forks in BRCA1-­ deficient  cells  can  recover  through  a  pathway  mediated  by  Rad18  and  Ubc13.  Furthermore,  when  BRCA1-­ deficient cells acquire PARP inhibitor resistance, fork protection is restored via a PALB2-­dependent mechanism,  which  relies on ATR  activity.  Notably,  both  Ubc13  and  PALB2  are  functionally  linked  to the  E3  ubiquitin  ligase  RNF168, raising the possibility that Ubc13, RNF168, and PALB2 may act in the same axis to protect stalled forks  and  promote  fork  recovery  independently  of  BRCA1.  We  hypothesize  that  both  Ubc13  and  PALB2  have  unanticipated  roles  in  fork  recovery/protection  in  the  absence  of  BRCA1,  and  their  functions  may  be  linked  by  RNF168.  Aim 2  will  investigate how  Ubc13 promotes  fork  recovery  in BRCA1-­deficient  cells,  how PALB2 and  ATR  protect  stalled  forks  in  BRCA1-­deficient  PARP  inhibitor-­resistant  cells,  and  whether  a  Ubc13-­RNF168-­ PALB2 axis promotes both fork protection and fork recovery in the absence of BRCA1. Collectively, these studies  will transform current models of fork stabilization and recovery in BRCA1-­proficient and -­deficient cells, providing  a mechanistic basis for new therapeutic strategies that exploit the replication stress in cancer cells.  Â