Mechanisms of microbial toxin and polysaccharide secretion

University Of Virginia, Charlottesville VA

Investigators

Abstract

Many  bacterial  pathogens  secrete  virulence  factors  to  perform  a  variety  of  biological  functions,  including  formation  of  cytolytic  pores,  modulation  of  host  immune  responses,  or  scavenging  nutrients.  The  Type  1  secretion  system  (T1SS)  is  widespread  among  pathogens  and  translocates  toxins  across  the  cell  envelope  in  Gram-­negatives.  One  T1SS  example  is  found  in  hemorrhagic  E.  coli  strains  that  secrete  hemolysin,  a  pore  forming  toxin.  T1SS  consist  of  inner  and  outer  membrane  components.  Integrated  into  and  anchored  to  the  inner membrane is an ABC transporter and a periplasmic membrane fusion protein, respectively, of which the  ABC  transporter  energizes  protein  translocation.  These  components  partner  with  an  outer  membrane  porin  to  facilitate  translocation  across  the  outer  membrane.  T1SS  substrates  can  be  extremely  long,  ranging  in  size  from  40  to  >900kDa.  Despite  their  lengths,  the  polypeptides  are  directly  channeled  from  the  cytosol  to  the  exterior of the cell. We already solved the crystal structure of the T1SS ABC transporter PrtD in a resting state.  Because  PrtD  is  only  functional  in  a  fully  assembled  T1SS  and  to  gain  insights  into  the  mechanism  of  T1SS-­ protein  secretion,  we  propose  to  determine  the  structure  of  a  stalled  T1SS  translocation  intermediate  by  cryo  electron  microscopy  (Aim  1).  Substrate  translocation  will  be  stalled  by  fusing  a  stably  folded  domain  to  the  substrate?s N terminus. T1SS translocate substrates C terminus first, which forms a stable Ca2+ binding domain  in the extracellular milieu. Thus, by introducing a stably folded domain to the substrate?s N terminus, the T1SS  is  trapped  between  folded  cytosolic  and  extracellular  domains.  To  generate  these  T1SS  translocation  intermediates, we assembled a functional T1SS in vivo from heterologously expressed and individually tagged  components.  This  system  secretes  the  substrate  PrtG  into  the  culture  medium  and  allows  trapping  of  translocation intermediates with GFP-­fused substrates.   Another  defense  mechanism  employed  by  many  Gram-­negative  pathogens  is  the  modification  of  lipopolysaccharides (LPS) with complex carbohydrates (O-­antigens), thereby preventing complement-­mediated  killing. O-­antigens are mostly linear polysaccharides about 100 to 400 sugar units long. A common biosynthetic  pathway involves the synthesis of fully assembled and lipid-­anchored O-­antigens on the cytosolic leaflet of the  inner  membrane,  after  which  the  polymer  is  transported  to  the  periplasmic  side  by  a  specific  ABC  transporter  before being attached to the outer core oligosaccharide of LPS. We already determined the crystal structure of  the  O-­antigen-­translocating  ABC  transporter  in  an  open  conformation,  revealing  a  continuous transmembrane  channel suitable to accommodate a polysaccharide chain. To unravel the mechanism by which this polymer is  translocation, we propose to determine the transporter?s substrate-­bound structure using O-­antigens of defined  lengths,  synthesized  in  vivo  or  in  vitro  (Aim  2).  Substrate-­bound  complexes  will  be  generated  by  co-­ crystallization or crystal-­soaking experiments with the purified substrates.