Chassis Optimization of Streptomyces Venezuelae for the Production of Thiotemplated Secondary Metabolites

University Of California Berkeley, Berkeley CA

Investigators

Linked publications, trials & patents

Abstract

Project Summary/Abstract    Members  of  the  Actinobacteria  phylum  (especially  those  from  the  Streptomyces  genus)  are  some  of  the  most  fruitful  sources  of  pharmaceuticals.  Discovery  of  bioactive  secondary  metabolites  from  these  species  has  moved  from  a  largely  ?grind  and  find?  strategy  (using  chemical  screens  and  bioactivity-­guided  fractionation)  to  a  more  targeted  ?genome  mining?  one  (using  modern  sequencing  and  algorithms).  However,  frequently  promising  biosynthetic  gene  clusters  from  these  species  are  found  in  unculturable  or  genetically  intractable  organisms.  Additionally,  because  of  our  greater  understanding  of  the  ?rules?  of  biosynthesis,  reprogramming  biosynthetic  pathways  through  synthetic  biology  is  of  considerable  interest.  Due  to  a  number  of  issues  with  folding, expression, and precursor supply, the workhorse chassis of synthetic biology, E. coli and S. cerevisiae,  have been shown to be imperfect for expressing proteins of actinomycetal origin. However, the development of  Streptomyces  as  a  chassis  for  synthetic  biology  endeavors  has  been  hindered  by  a  number  of  features  including: a slow growth rate, a high GC genome (which complicates genetic manipulations), and a myceliating  phenotype in liquid media. This proposal seeks to capitalize on the recent work to develop genetic tools for this  class  of  bacteria  (including  orthogonal  integration  vectors;?  characterization  of  promoters,  ribosomal  binding  sites,  and  expression  systems;?  and  application  of  the  CRISPR/Cas9  genome  editing  platform)  to  improve  a  strain  that  naturally  has  attractive  growth  characteristics  relative  to  other  Streptomyces  strains,  Streptomyces  venezuelae  ATCC  10712.  Specifically,  this  work  is  focused  on  issues  related  to  heterologous  expression  of  and  metabolite  formation  by  bacterial  megasynthase  enzymes  that  form  ?thiotemplated?  natural  products,  polyketides  (generated  by  polyketide  synthases,  PKSs)  and  non-­ribosomal  peptides  (generated  by  non-­ ribosomal peptide synthetases, NRPS). To address this challenge, several approaches will be employed. First,  using  the  CRISPR/Cas9  genome  editing  platform,  a  genome  minimized  version  of  Streptomyces  venzueale  ATCC  10712  will  be  generated  to  reduce  background  expression  and  improve  growth  characteristics.  Then,  various  sites  on  the  chromosome  will  be  probed  to  determine  where  the  level  of  transcription  (and  thus  translation) are the highest (first with the fluorescent protein, mCherry, then with an NRPS-­PKS hybrid natural  product  biosynthetic  pathway).  Finally,  the  bottlenecks  in  posttranslational  modification  and  precursor  supply  will  be  evaluated  and  addressed  through  metabolic  engineering.  The  modifications  to  Streptomyces  venezueale  ATCC  10712  will  undoubtedly  accelerate  discovery  and  optimization  through  providing  a  better  chassis organism to produce natural and engineered metabolite scaffolds.