REPROGRAMMING BOTULINUM NEUROTOXIN PROTEASES THROUGH CONTINUOUSEVOLUTION AS A STRATEGY FOR DEVELOPING SELECTIVE INTRACELLULAR THERAPIES

Broad Institute, Inc., Cambridge MA

Investigators

Linked publications & trials

Abstract

PROJECT SUMMARY  Over  the  last  few  decades,  the  medical  community  has  witnessed  a  remarkable  shift  in  the  composition  of  pharmaceutical  therapies  from  traditional  small  molecules  to  biomacromolecules.  Despite  their  tremendous  success,  macromolecular  therapies  have  been  limited  almost  exclusively  to  extracellular  targets  due  to  the  significant  challenge  of  their  controllable  delivery  into  the  cytoplasm.  To  overcome  this  critical  barrier  in  expanding the scope of macromolecuar therapy, naturally occurring self-­deliverable protein systems such as the  Botulinum  neurotoxins  (BoNTs)  offer  an  attractive  solution.  These  protein  complexes  recognize  cholinergic  neurons, and promote the translocation of the active toxin component, the BoNT LC protease, into the cytosol  where it deactivates the cellular machinery responsible for membrane fusion events through proteolysis. While  potent, BoNT LC proteases are highly specific catalysts, and generally only recognize a single substrate. Efforts  to reprogram the activity of BoNT LC proteases have met with limited success, and the inaccessibility of new  intracellular targets for BoNT LC proteases remains the primary barrier in extending BoNT-­derived therapeutic  strategies. Recently, phage assisted continuous evolution (PACE) has emerged as a powerful tool for the rapid  evolution of novel activity, and has been applied to the exploration of the mechanisms by which viral proteases  develop resistance to inhibitors, and to evolving new substrate activities in viral proteases. This work will extend  the PACE strategy to reprogram the BoNT F LC protease to cleave novel target sequences, and will be applied  to  the  intracellular  proteolytic  deactivation  of  the  therapeutically  relevant  SNARE  protein  VAMP7.  With  this  in  mind,  the  goals  of  this  proposal  are:  (1)  adapt  the  current  protease  PACE  platform  for  use  with  BoNT  LC  proteases and evolve a BoNT LC protease to selectively cleave the SNARE protein VAMP7;? (2) develop a PACE  negative selection and apply this selection to evolve BoNT LC proteases that cleave VAMP7 with high specificity;?  (3) characterize in depth the activity, specificity, and potential therapeutic relevance of the evolved proteases.  This  work  will  provide  a  strong  foundation  upon  which  future  catalytic  intracellular  protease  therapies  can  be  based.