Structure and Mechanism of HECT E3 Ubiquitin Ligases

Clark University (Worcester, Ma), Worcester MA

Investigators

Linked publications & trials

Abstract

Project Summary    Many human diseases are caused when a protein or enzyme is mutated or misfolded.  For example, the dysfunction of  the  HECT  (Homologous  to  E6AP  Carboxyl  Terminus)  E3  ubiquitin  ligases  has  been  linked  to  neurodevelopmental  syndromes  (i.e.  Angelman,  Prader-­?Willi  and  Wolfram),  Huntington?s,  cancer  (i.e.  breast,  lung,  prostate,  and  Wilms?  tumors),  and  viral  infections  (i.e.  HIV,  HPV,  Ebola,  and  Influenza  A/B).    It  is  paramount  that  we  understand  how  these  enzymes work to aid in the future development of therapies to treat HECT E3 ubiquitin ligase dysfunction and enhance  human health.  The HECT E3 ubiquitin ligases are enzymes involved in the ubiquitylation-­?signaling pathway that coordinate  the posttranslational attachment of the 8.5 kDa signaling protein ubiquitin to their specific target proteins in the cell.   The objective of this project is to understand the structural and biochemical basis for HECT-­?dependent ubiquitylation.  We  will elucidate the unique mechanisms that the 28 human members of the HECT E3 ubiquitin ligase family use to attach  ubiquitin  to  their  intracellular  substrates.    All  28  HECT  E3  ubiquitin  ligases  encoded  in  the  human  genome  contain  the  characteristic  HECT  domain,  consisting  of  an  N-­?terminal  lobe  and  a  C-­?terminal  lobe,  that  is  responsible  for  catalyzing  ubiquitin chain attachment to a target protein.  Currently the mechanism that each of these 28 unique enzymes uses and  the  identities  of  specific  residues  in  and  around  the  active  site  required  for  catalysis  remain  unclear.    The  long  term  scientific goal of the PI is to fully investigate the 3D structures and underlying enzymology for the C-­?terminal lobes of all 28  human HECT E3 ubiquitin ligases to learn how this region of each enzyme controls polyubiquitin chain assembly and linkage  specificity.  The  major  foci  of  this  proposal  will  be  to  determine  the  role  of  dynamics  and  conformational  flexibility  in  HECT-­? dependent ubiquitylation (Aim 1), and to decipher the catalytic mechanisms and the role of dimerization in regulating  HECT  E3  ligase  activity  (Aim  2).    Our  preliminary  studies  using  NMR  spectroscopy  and  other  biochemical  approaches  suggest  that  some  of  the  HECT  E3  ubiquitin  ligases  use  novel  mechanisms  found  exclusively  in  their  HECT  domain  C-­? terminal lobes that contain the absolutely conserved catalytic cysteine.  These inherent differences provide an enticing  opportunity to expand our current understanding of HECT-­?dependent ubiquitylation.  Our findings will offer new insight  into the molecular mechanisms used by the HECT E3 ubiquitin ligases and help us learn how and why HECT E3 ubiquitin  ligase dysfunction occurs and can possibly be controlled.  Undergraduate students will be an essential part of the success  of  this  R15  AREA  research  project.    The  contribution  from  Biochemistry  and  Molecular  Biology  (BCMB)  undergraduate  students at Clark University will be integral to the completion of the proposed work and, as a result of their importance in  this  research  program,  they  will  receive  extensive  guidance  from  the  PI  and  will  share  in  manuscript  preparation  and  publication authorship.